Wissenschaftler an der Harvard Medical School und Boston Children ‚ s Hospital haben eine neuartige gen-editing-Ansatz, um zu retten, das Gehör von Mäusen mit genetisch bedingter Hörverlust und das ist ihm gelungen, ohne jede scheinbare off-target-Effekte als Folge der Behandlung.

Die Tiere — bekannt als Beethoven — Mäusen behandelt wurden, den gleichen genetischen mutation, die bewirkt, dass progressive Hörverlust bei Menschen, die Ihren Höhepunkt in schweren Taubheit durch Ihre Mitte der 20er Jahre.

Der neue Ansatz, beschrieben online 3. Juli in Nature Medicine , beinhaltet eine optimierte und präzisere version des klassischen CRISPR-Cas9-gen-editing-system, das ist besser zu erkennen, die Krankheit-verursachende mutation gesehen, die in der Beethoven-Mäusen. Die raffinierte tool erlaubt Wissenschaftler selektiv zu deaktivieren, das defekte Kopie einer Anhörung gen namens Tmc1, während Schonung des gesunden kopieren.

Insbesondere, berichten die Forscher, deren verwaltete system zu erkennen, eine einzige falsche DNA-Buchstaben in das schadhafte Exemplar unter den 3 Milliarden Buchstaben in das Maus-Genom.

Viel mehr Arbeit getan werden, bevor auch eine sehr präzise gen-editing-Therapie wie dieser könnte verwendet werden, in den Menschen, die Forscher darauf hingewiesen. Aber Sie sagte, die Arbeit ist ein Meilenstein, weil es verbessert die Wirksamkeit und Sicherheit von standard-gen-editing-Techniken.

„Unsere Ergebnisse zeigen, dass diese feinere, gezieltere version des jetzt-classic CRISPR/Cas9 editing-tool erreicht ein nie dagewesenes Maß an Identifikation und Genauigkeit,“ sagte Studie co-senior investigator David Corey, der Bertarelli-Professor für Translationale Medizin in der Blavatnik-Institut an der Harvard Medical School.

Darüber hinaus, das team sagte, die Ergebnisse bilden die Bühne für die Verwendung der gleichen Präzision Ansatz zur Behandlung von anderen dominant vererbt genetische Krankheiten, die sich aus einer einzigen fehlerhaften Kopie des Gens.

Jeder erbt zwei Kopien des gleichen Gens-eine von jedem Elternteil. In vielen Fällen, ein normales gen ist ausreichend, um sicherzustellen, die normale Funktion, dass die Ersatzteile den einzelnen vor der Erkrankung. Im Gegensatz dazu, in so genannten dominant vererbten genetischen Störungen, einer einzigen fehlerhaften Kopie, die Krankheit verursachen kann.

„Wir glauben, dass unsere Arbeit öffnet die Tür in Richtung einer hyper-gezielte Art und Weise zu behandeln eine Reihe von genetischen Störungen, die sich aus einer fehlerhaften Kopie des Gens,“ sagte Studie co-senior investigator Jeffrey Holt, Harvard Medical School professor für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde und der Neurologie an der Boston-Kinderklinik, die ist auch verbunden mit der F. M. Kirby Neurobiology Center an der Boston Kinder. „Das ist wirklich Präzision-Medizin.“

Die Mäuse, die das fehlerhafte gen Tmc1 sind bekannt als Beethoven die Mäuse, weil Sie den Verlauf Ihrer Krankheit imitiert die progressiven Hörverlust erlebt der berühmte Komponist. Die Ursache von Ludwig van Beethovens Taubheit, jedoch bleibt eine Frage der Spekulation.

In Mäusen, die Beethoven-Mangel ist gekennzeichnet durch einen falschen Buchstaben in der DNA-Sequenz von dem gen Tmc1 — ein A statt ein T — einen einzigen Fehler, der Zauber der Unterschied zwischen dem normalen Hörvermögen und der Taubheit.

Deaktivieren oder Inaktivierung der mutierten Kopie des Tmc1-gen genügen würde, um die Erhaltung der Tiere zu hören, aber wie könnte es getan werden, ohne versehentlich zu deaktivieren das gesunde gen auch?

Zwei Schlüssel sind besser als einer

Klassische CRISPR-Cas9-gen editing-Systeme arbeiten mit einem leitenden Molekül — gRNA-zu identifizieren, die Ziel-Mutante DNA-Sequenz. Sobald die Ziel-DNA aufgezeigt, die Schneide-Enzym — Cas9 — snips es.

So weit, dass diese gen-Redaktion haben gezeigt, weniger-als-perfekte Genauigkeit. Dies ist, weil die guide-RNA führt, dass das Cas9-Enzym zu der Ziel-Website und das Cas9-Enzym, das schneidet die Ziel-DNA sind nicht ganz präzise und konnte am Ende schneiden der falschen DNA.

Zu umgehen sind diese Herausforderungen, die Forscher angepasst, ein Werkzeug, das ursprünglich entwickelt von Keith Junge, HMS professor der Pathologie, und Ben Kleinstiver, HMS assistant professor für Pathologie am Massachusetts General Hospital, die nutzt eine modifizierte Cas9-Enzym, abgeleitet von Staphylococcus aureus statt des standard-Cas9, abgeleitet von dem Bakterium Streptococcus pyogenes.

Zu erreichen erhöhte Genauigkeit der Erkennung und der Störung, der neue, optimierte system verbindet zwei Ebenen der Anerkennung — gRNA zum Auffinden der target-Gens und eine modifizierte form von Cas9 kann die Bearbeitung spezifischer DNA-mutation im Beethoven-Mäusen. Die Verwendung von zwei Formen der Identifikation sorgt für die präzise und selektive schneiden die anomale kopieren — und nur die aberrante Exemplar — von, dass gen.

„Wir nutzten die Tatsache, dass dieses system erkennt Mutanten-DNA, aber nicht normal, DNA und verwendet einen dual-Anerkennung system für verbesserte Präzision,“ sagte Studie erste Autor Bence György, wer hat die Arbeit, während an der Harvard Medical School und ist jetzt am Institut für Molekulare und Klinische Ophthalmologie in Basel, der Schweiz. „Dieser Ansatz führte zu einem beispiellosen Maß an Spezifität in der Ausrichtung des mutierten Gens.“

In einem ersten set von Experimenten in Zellen mit und ohne die Beethoven-mutation, das tool genau unterschieden zwischen Mutanten-DNA und normal-DNA in Kopien der gen Tmc1. Die weitere Analyse ergab, dass im Beethoven-Zellen, die enthalten eine defekte und eine normale Kopie des Gens, die mindestens 99 Prozent der molekularen „Schnitte“ traten ausschließlich in der fehlerhaften Kopie des Gens.

Als Nächstes Forscher injizierten das gen-editieren-Behandlung in die inneren Ohren von Mäusen mit und ohne das Beethoven-mutation. DNA-Analyse zeigte, dass die Bearbeitung der Aktivität trat nur in der Innenohr-Zellen von Mäusen, die mit dem Beethoven-Mangel. Keine änderungen entdeckt wurden Zellen aus dem inneren Ohren der behandelten Mäuse, die nicht die mutation — ein Befund, bestätigt, dass das Werkzeug die Präzision.

Um zu bestimmen, ob das gen-editing-Therapie beeinträchtigt die normale genfunktion, die Wissenschaftler angeregt Hörgeräte-Zellen-genannt Haar-Zellen — aus dem inneren Ohren der behandelten Mäuse, die nicht tragen, der Beethoven-Mangel. Die Zellen zeigten unverändert, normal hören, Antworten, bekräftigend, dass die gen-editing-Therapie hatte keinen Einfluss auf die normale gen-Funktion.

Silencing Beethoven

Um zu Messen, ob die Therapie funktionierte bei Tieren, anstatt nur in den Zellen, die Forscher führten das gold-standard-test für die Anhörung. Sie Maßen die Tiere auditorischen Hirnstamm-Antworten, die erfassen, wie viel sound wird erkannt, durch die Haarzellen im Innenohr an das Gehirn übermittelt.

Ohne Behandlung, Beethoven-Mäuse sind in der Regel völlig taub Alter von 6 Monaten. Durch den Vergleich, die Mäuse ohne Gendefekt behalten normalen Hörgeräte-das ganze Leben und können erkennen, klingt auf rund 30 Dezibel-ein Maß ähnlich einem flüstern.

Zwei Monate nach Erhalt des gen-editing-Therapie, Beethoven-Mäuse zeigten deutlich besser hören als unbehandelte Geschwister tragen die genetische mutation. Die behandelten Tiere waren in der Lage zu erkennen, klingt in etwa 45 Dezibel — dem Niveau einer normalen Unterhaltung-oder etwa 16-mal leiser als die unbehandelten Mäuse. Die Beethoven-Maus, die mit der größten Hörgeräte-Bewahrung der Lage war, hören von Klängen bei 25 bis 30 Dezibel, der sich praktisch nicht von Ihren gesunden Altersgenossen.

Zusammen genommen, die Ergebnisse zeigen, dass das neuartige gen-Therapie effektiv zum schweigen gebracht, die defekte Kopie des Gens und geborgen die Tiere hören von den schnellen Niedergang der Regel zu sehen, der in der Krankheit.

Weil die Krankheit ist gekennzeichnet durch den progressiven Verlust der Hörfähigkeit, bewerteten die Forscher die Wirkung der Therapie auf die progression über mehrere Monate. Die Forscher verabreichten Behandlung kurz nach der Geburt getestet und Hör-Ebenen in behandelten und unbehandelten Mäusen mit und ohne die mutation, die alle vier Wochen bis zu sechs Monaten. In einem Monat, unbehandelt Beethoven-Mäusen konnte hören, wie niedrig-Frequenz-Töne, hatte aber Bemerkenswerte Hörverlust bei hohen Frequenzen. Von Monat sechs nach der Geburt, unbehandelt Beethoven Mäuse hatte alles verloren, was Ihr Gehör. Im Gegensatz dazu behandelt Beethoven Mäuse beibehalten der Nähe-normale Gehör bei den niedrigen Frequenzen, mit einige, die in der Nähe-normal hören, auch bei hohen Frequenzen.

Vor allem, behandelt Tiere, die nicht tragen den genetischen defekt nicht Gehörverlust als Folge des gen-Therapie-eine Feststellung, die nachweislich die Sicherheit des Verfahrens und seine Fähigkeit, selektiv Ziel-die aberrante Kopie des Gens. Noch mehr erfreulich, eine kleine Teilmenge der behandelten Beethoven Mäuse, die verfolgt wurden, für fast ein Jahr beibehalten stabilen, nahezu normalen hören.

Denn das Beethoven-Mangel ist gekennzeichnet durch den fortschreitenden Verfall und Tod der Hörzellen im Innenohr, die Forscher verwendeten Elektronen-Mikroskopie zur Visualisierung der Struktur dieser kritischen Anhörung Zellen. Wie erwartet, in der unbehandelten Beethoven Mäusen sahen die Forscher allmählichen Verlust der Hörgeräte-Zellen zusammen mit einer Verschlechterung Ihrer Struktur. Dagegen behandelt Beethoven Mäuse und behandelt die gesunden Mäuse beide behielten eine normale Anzahl von Hörgeräte-Zellen mit intakten oder fast intakten Struktur.

In einem abschließenden experiment testeten die Wissenschaftler die Wirkung der Behandlung in einer Zeile der menschlichen Zellen tragen das Beethoven-mutation. DNA-Analyse ergab, dass die Behandlung verursacht die Bearbeitung ausschließlich in der Mutante Kopie der gen Tmc1 und verschont die normale.

Wegen seiner Fähigkeit bis Ziel single-point-genetische Mutationen, der Ansatz hält Versprechen für die 15 anderen Formen der vererbten Taubheit verursacht durch eine einzelne-Buchstaben-mutation in der DNA-Sequenz von anderen zu hören Genen.

Außerdem, das team sagte, dass Ihre Technik angepasst werden können, für die Verwendung in anderen dominant vererbt genetische Krankheit, verursacht durch ein-Punkt-Mutationen. Um zu bestimmen, seine hypothetischen Dienstprogramm, das Wissenschaftler gescannt die Bundes-ClinVar Datenbank — eine nationale repository der alle bekannten genetischen Mutationen im Zusammenhang mit menschlichen Erkrankungen. Die Analyse zeigte, dass, basierend auf dem tool-Spezifität, könnte es korrekt zu identifizieren, 3,759 defekte Genvarianten, die Kollektiv verantwortlich für ein Fünftel der dominante genetische Mutationen.

„Um sicher zu sein, das ist der erste Schritt in einer langen Reise“, sagte Holt. „Aber was wir hier haben, ist Beweis des Prinzips, dass demonstriert dieses sehr spezifische, zielgerichtete Behandlung entwickelt werden könnte, um selektiv Stille Gene tragen, dass ein-Punkt-Mutationen und möglicherweise der Behandlung von vielen anderen Formen der menschlichen Krankheit.“